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凝胶过滤色谱的原理主要基于分子在凝胶颗粒中的扩散和筛分作用。当样品溶液通过凝胶色谱柱时,不同大小的分子会受到不同程度的阻碍。大分子物质由于直径较大,不易进入凝胶颗粒的微孔,因此沿凝胶颗粒间隙向下移动,流程较短,迁移速度快,路径较短,所以最先流出色谱柱;小分子物质除了可在凝胶颗粒间隙中扩散外,还可以进入凝胶颗粒的微孔中,即进入凝胶相内,向下移动的过程中,从一个凝胶颗粒内扩散到颗粒间隙然后再进入另一凝胶颗粒,如此不断地进入和扩散,小分子物质的下移速度落后于大分子物质,从而使样品中分子大的先流出色谱柱,中等分子的后流出,分子最小的最后流出,这种现象又称为分子筛现象。